E14 小鼠胚胎幹細胞/鏡像綺點（iCell）

E14 小鼠胚胎幹細胞/鏡像綺點（iCell）特性

1） 來源：小鼠，胚胎內(nei) 細胞團

2） 形態：球形克隆

3） 含量：>1x106 個(ge) /mL

4） 汙染：支原體(ti) 、細菌、酵母和真菌檢測為(wei) 陰性

5） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運輸和保存

可選擇幹冰運輸及發送複蘇存活細胞方式

（1）幹冰運輸，收到後立即轉入液氮凍存或直接複蘇；

（2）存活細胞，收到後應繼續生長，傳(chuan) 代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。

（3）具體(ti) 操作見細胞培養(yang) 步驟。收到細胞後請拍照，3天內(nei) 如果發現汙染，請及時拍照與(yu) 我們(men) 聯係。

細胞接受後的處理：

1） 收到細胞後，請檢查發貨培養(yang) 瓶的狀況，若發現培養(yang) 瓶破損、有液溢出及細胞有汙染，請拍照後及時聯係我們(men) 。

2） 在顯微鏡下確認細胞生長狀態時，在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳(chuan) 代密度。看細胞的形態請在10X和20×物鏡下，同時給細胞拍照各2-3張（10×，20×都要拍照），作為(wei) 售後的依據。

3） 觀察好細胞狀態後，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置於(yu) 37℃培養(yang) 箱放置約2-3h。

4） 貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會(hui) 有脫落的現象，如發現貼壁細胞有脫落或者脫落後抱團生長，可將T25瓶置於(yu) 37℃培養(yang) 箱放置約2-3h，然後抽出瓶中的培養(yang) 基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鍾，棄去上清重懸後接種到加有按照說明書(shu) 細胞培養(yang) 條件新配製的*培養(yang) 基的原培養(yang) 瓶中（或新的培養(yang) 瓶中）。

5） 懸浮細胞：T25瓶置於(yu) 37℃培養(yang) 箱放置約2-3h，然後抽出瓶中的培養(yang) 基和細胞1000rpm離心5分鍾，棄去上清重懸後接種到新的培養(yang) 瓶中（加入按照說明書(shu) 細胞培養(yang) 條件新配製的*培養(yang) 基）。

6）備注：運輸用的培養(yang) 基（灌液培養(yang) 基）不能再用來培養(yang) 細胞，請換用按照說明書(shu) 細胞培養(yang) 條件新配製的*培養(yang) 基來培養(yang) 細胞。  收到細胞後*次傳(chuan) 代建議1：2傳(chuan) 代 。

細胞用途：僅(jin) 供科研使用。

E14 小鼠胚胎幹細胞/鏡像綺點（iCell）培養(yang) 操作規程，供參考

一．培養(yang) 基及培養(yang) 凍存條件準備：

1） 準備DMEM（推薦iCell-0001）培養(yang) 基；優(you) 質胎牛血清，15%；L-Glu，1%；NEAA，1%；丙酮酸鈉，1%；添加1uL/mLβ-Mer和0.1uL/mLLIF；雙抗，1%；培養(yang) 瓶用0.1%明膠包被

2） 培養(yang) 條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yang) 箱濕度為(wei) 70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 複蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水麵要低於(yu) 凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yang) 基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，加入1mL培養(yang) 基後吹勻。然後將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yang) 基的培養(yang) 瓶中培養(yang) 過夜。第二天換液並檢查細胞密度。

2） 細胞傳(chuan) 代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳(chuan) 代培養(yang) 。

對於(yu) 貼壁細胞，傳(chuan) 代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yang) 上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）於(yu) 培養(yang) 瓶中，置於(yu) 37℃培養(yang) 箱中消化1-2分鍾，然後在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並脫落，迅速拿回操作台，輕敲幾下培養(yang) 瓶後加入3ml此細胞的培養(yang) 基終止消化。

3. 輕輕吹打後吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鍾，棄去上清液，加入1mL培養(yang) 液後吹勻。

4. 收到細胞後*傳(chuan) 代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yang) 基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，後續傳(chuan) 代根據實際情況按1:2到1:5的比例進行。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

下麵T25瓶為(wei) 類；

1，細胞凍存時，棄去培養(yang) 基後，PBS清洗一遍後加入1ml胰酶，細胞變圓脫落後，加入1ml*培養(yang) 基終止消化，可使用血球計數板計數。

2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據細胞數量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為(wei) 10%，細胞密度1-2xE6/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3，將凍存管置於(yu) 程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(ge) 小時以後轉入液氮灌儲(chu) 存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

18新利苹果客户端密码主要產(chan) 品和服務介紹：

        一、原代細胞服務：
               各類模式哺乳動物的多種原代細胞資源
               多種人源性正常及腫瘤原代細胞資源
               原代細胞分離和培養(yang) 相關(guan) 試劑、kit、培養(yang) 基添加劑等
               原代細胞相關(guan) 技術服務及整體(ti) 實驗外包服務

        二、細胞係服務：
               細胞株/係培養(yang) 、增殖、凍存和相關(guan) 說明書(shu)
               細胞係培養(yang) 過程的技術指導
               細胞係培養(yang) 基、添加劑、血清及相關(guan) 生長因子、試劑等

        三、iPS細胞服務：
               iPS細胞基礎培養(yang) （有滋養(yang) 層or無滋養(yang) 層）
               iPS細胞增殖及冷凍保存
               iPS基礎培養(yang) 技術實習(xi)
               新藥及實驗儀(yi) 器上市前評估

        四、其他技術外包服務、客戶定製服務等

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