MTT法細胞活性檢測

MTT檢測法，是一種檢測細胞存活和生長增殖的方法。
檢測原理：活細胞線粒體(ti) 中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為(wei) 水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞(ya) 碸(DMSO )能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀(yi) 在490nm波長（或其他波長）處測定其光吸收值，在一定細胞數量範圍內(nei) ，MTT結晶形成的量與(yu) 細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。
該方法靈敏度高、經濟實用，已廣泛用於(yu) 一些生物活性因子的活性檢測、大規模藥物篩選、細胞毒性試驗以及細胞放射敏感性測定等等。

MTT主要有兩(liang) 個(ge) 用途：（1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體(ti) 外培養(yang) 的細胞毒性的測定；（2）細胞增殖及細胞活性測定。

MTT法細胞活性檢測

MTT方法能簡單、快捷、準確地測定細胞的增殖反應，並且其價(jia) 格低廉，成為(wei) 日前各實驗室檢測細胞活性的shou選方法之一。其檢測原理為(wei) 活細胞線粒體(ti) 中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為(wei) 水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞(ya) 碸（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀(yi) 在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數範圍內(nei) ，MTT結晶形成的量與(yu) 細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值）來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。

一、MTT 溶液的配製

1、MTT 溶液的配製通常MTT 配成的終濃度為(wei) 5mg/ml，須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市麵上一般MTT的包裝為(wei) 100mg，250mg或1g。對於(yu) 100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個(ge) 人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配製成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。具體(ti) 做法：預先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yang) 瓶替代）加入20ml PBS，從(cong) 中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若幹次後將其移入50ml離心管，然後再混勻。可以重複幾次，以使小管中的MTT不殘留於(yu) 管內(nei) 。將MTT*混勻後，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液裏的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存於(yu) -20℃。按細胞培養(yang) 板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。對於(yu) 大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管裏，用的時候現配，直接往培養(yang) 板中加。

2、注意事項：

（1）在配製和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。

（2）配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感。

（3）MTT一般現用現配，過濾後4℃避光保存兩(liang) 周內(nei) 有效，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反複凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為(wei) 灰綠色時就不能再用。

（4）MTT有致癌性，使用時需小心。

MTT法細胞活性檢測

二、MTT甲瓚溶解液

1、二甲基亞(ya) 碸DMSO：可以直接溶解，無需配製，使用方便，溶解速度快，但對人體(ti) 毒性較大，且需去除原培養(yang) 液，在去除培養(yang) 液的過程中，可能會(hui) 把結晶去掉，導致結果不穩定。

2、三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，用雙蒸水溶解配成100ml溶液，該溶解液不需去除原培養(yang) 基，但溶解較慢。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chan) 生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解後再使用。

三、MTT法實驗步驟

1、yi酶消化對數期細胞，終止後離心收集，製成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。

2、將細胞懸液製備好後，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為(wei) 5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。

注意：因細胞在混勻後仍要繼續沉降，因此接種的過程中要反複多次混勻，如每加6個(ge) 孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同，這對於(yu) MTT的結果至關(guan) 重要。

3、將接種好的細胞培養(yang) 板放入培養(yang) 箱中培養(yang) ，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物。原則上，細胞貼壁後即可加藥（兩(liang) 小時——半天時間），但我們(men) 常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(ge) 梯度，每孔100ul，設3-5個(ge) 複孔，建議設6個(ge) ，否則難以反應真shi情況。

注意：對於(yu) 加藥，有人直接將藥物按不同體(ti) 積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為(wei) 應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然後將96孔板中的培養(yang) 上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yang) 基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yang) 液全部吸走後再加藥，應該吸完一部分後立即加樣，避免由於(yu) 96孔板幹燥引起細胞死亡。

4、5%CO2，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。

5、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養(yang) 4h。

6、終止培養(yang) ，準備溶解結晶。

溶解結晶的方法有兩(liang) 種，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培養(yang) 4h後，結晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌麵，然後將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損失。

2) 每孔加入150ul二甲基亞(ya) 碸，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀(yi) OD490nm處測量各孔的吸光值。

另一種方法，用三聯溶解液：

1) MTT加入培養(yang) 4h後，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chan) 生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解後再使用。）

2) 放入培養(yang) 箱中繼續孵育4—6小時，鏡下觀察，待結晶全部溶解後570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右，紫色結晶會(hui) 全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會(hui) 短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會(hui) 長一些。

7、同時設置調零孔（培養(yang) 基、MTT、二甲基亞(ya) 碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yang) 液、MTT、二甲基亞(ya) 碸）。

四、MTT結果分析

關(guan) 於(yu) 如何計算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 大劑量

I：lg(大劑量/相臨(lin) 劑量)

P0：陽性反應率之和

Pm：大陽性反應率

Pn：小陽性反應率

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