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400-021-2021
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豬骨骼肌衛星細胞永生化分離培養及鑒定、轉染方法
更新更新時間：2024-05-15 瀏覽次數：677
骨骼肌細胞是人和動物體(ti) 內(nei) 最大的細胞之一，它們(men) 是由成肌細胞(Myoblasts)融合而來的多核細胞，故骨骼肌的形成是一個(ge) 非常複雜的過程，並需要多種細胞信號通路的參與(yu) ，包括phosphatidylinositol 3-kinase，calcineurin，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌細胞的培養(yang) 是研究細胞分化過程的有效的模型。
該細胞通過慢病毒轉染的方式攜帶SV40基因。
細胞來源於(yu) 正常動物肌肉組織，通過肌動蛋白（α-actin）免疫熒光染色鑒定為(wei) 陽性，細胞純度高於(yu) 90%。細胞形態位梭形，不規則細胞，貼壁培養(yang) 。
1.試驗所需儀(yi) 器設備及試劑
（1）儀(yi) 器
儀(yi) 器名稱 | 規格型號 | 廠家 |
生物安全櫃 | BSC-1500ⅡA2-X | 濟南鑫貝西生物技術有限公司 |
CO2細胞培養(yang) 箱 | BC-J160S | 上海博迅實業(ye) 有限公司 |
熒光倒置顯微鏡 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷凍離心機 | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
電熱恒溫鼓風幹燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏實驗設備有限公司 |
電熱恒溫震蕩水槽 | DK-2B | 上海精宏實驗設備有限公司 |
（2）試劑耗材
試劑名稱 | 規格/貨號 | 廠家 |
T25細胞培養(yang) 瓶 | 430639 | Corning |
血球計數板 | Neubauer improved | Marienfeld |
24孔板專(zhuan) 用細胞爬片 | YA0350 | Solarbio |
細胞培養(yang) 孔板 | WHB-24 | 上海臥宏生物科技有限公司 |
胎牛血清 | 1414426 | Gibco |
骨骼肌衛星細胞專(zhuan) 用培養(yang) 基 | Primed-iCell-018 | 賽百慷（上海）生物技術股份有限公司 |
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA） | 1734858 | Gibco |
Collagenase Ⅰ | 17018029 | Gibco |
Collagenase Ⅱ | 17101015 | Gibco |
Collagenase Ⅳ | 17104019 | Gibco |
多聚甲醛（PFA） | P1110 | Solarbio |
DAPI | C0060 | Solarbio |
Triton X-100 | T8200 | Solarbio |
山羊血清 | SL038 | Solarbio |
Myod | 18943-1-AP | Proteintech |
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | SA00013-4 | Proteintech |
Fluoromount-G熒光封片劑 | 0100-01 | SourthernBiotech |
2．豬骨骼肌衛星細胞的分離培養(yang)
1) 首先將豬頸部動脈放血致死。
2) 小心剪取後肢肌肉，剔除脂肪，筋膜，血管等，
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次，
4) 將肌肉組織剪碎，
5) 加入3倍體(ti) 積的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型膠原酶4℃冰箱過夜消化，
6) 第二天，將混合液取出置於(yu) 37℃水浴鍋中震蕩消化1h，
7) 過100目篩網，
8) 收集濾液，
9) 300g 離心5 min，
10) 重懸沉澱，鋪瓶
細胞分離培養(yang) ：
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原圖見文件-細胞分離培養(yang)
3．免疫熒光鑒定
3.1實驗步驟
（1）細胞爬片
取3片玻璃片於(yu) 24孔板中，每孔加入培養(yang) 基1mL，加入細胞0.02million個(ge) /孔。置培養(yang) 箱2h或過夜。
（2）固定
細胞爬片後，吸出培養(yang) 基，用PBS洗1遍，加入4% PFA於(yu) 4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最後一次不吸出PBS，放4℃過夜。
（3）破膜封閉
將玻片除去水分，置於(yu) 培養(yang) 皿支撐物上，
玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與(yu) PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封閉液滴於(yu) 防水膜上，將玻片上有細胞的一麵蓋上2h。
（4）一抗孵育
一抗配製：抗體(ti) 與(yu) PBS 1:100（200）稀釋
破膜封閉後，取50uL一抗於(yu) 防水膜上（濕盒中），將玻片（有細胞的一麵）蓋上置於(yu) 4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h後，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細胞的一麵蓋上。
鑒定細胞為(wei) P1代細胞
一抗為(wei) Myod
3.2免疫熒光鑒定結果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原圖見文件-免疫熒光
4.轉染
4.1SV40過表達慢病毒基本信息
實驗信息表： | ||||
產(chan) 品名稱 | SV40過表達慢病毒 | |||
載體(ti) 信息 | 載體(ti) 元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
攜帶熒光標記 | GFP □ RFP□ | 抗性基因標記 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
載體(ti) 圖譜 |
| |||
載體(ti) 目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黃色區域為(wei) 目的序列區 | ||||
4.2轉染
（1）將細胞接種6孔板，每孔細胞數約為(wei) 1×105 個(ge) ，
（2）第二天，待細胞貼壁後，換液，
（3）加入1mLwan全培養(yang) 基，再加20 μL SV40過表達慢病毒，
（4）混勻後繼續培養(yang) ，
（5）12h後觀察細胞狀態，並更換為(wei) 新鮮培養(yang) 基，
（6）當細胞長滿板底後，傳(chuan) 代至T25培養(yang) 瓶中。
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原圖見文件-轉染
5.篩選
5.1殺滅曲線的確定
（1）將未轉染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yang) 基，
（3）將含不同濃度嘌呤黴素（1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL）的新鮮培養(yang) 基加入已鋪有細胞的24孔板，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yang) 基，
（5）每天觀察細胞的存活比例，
（6）最小的嘌呤黴素使用濃度就是從(cong) 嘌呤黴素篩選開始1-4d內(nei) 殺死所有細胞的zui低篩選濃度。
結果：嘌呤黴素的使用濃度為(wei) 2μg/mL，作用時間為(wei) 2d。
5.2嘌呤黴素篩選轉染細胞
（1）第一天，將轉染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yang) 基，
（3）加入含嘌呤黴素（2μg/mL）的篩選培養(yang) 基，孵育，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yang) 基，
（5）每天觀察細胞的存活比例，
（6）在同一時間點（2d）存活的細胞，即為(wei) 轉染成功的細胞，
（7）對篩選後的細胞進行擴增。
6.細胞擴增
將篩選後的細胞進行擴增，篩選後的細胞為(wei) P1代，擴增至少到12代。
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