製成免疫熒光容易出現的問題和注意事項

在製作原代細胞免疫熒光時，容易出現一些問題，造成熒光鑒定失敗，將抗原或抗體(ti) 標記上熒光素，製成熒光抗體(ti) 檢測組織或細胞內(nei) 的相應抗原（或抗體(ti) ）時，一定要注意抗體(ti) 的比例高低和濃度。

製作免疫熒光常用的方法有：

方法一：直接法

步驟：將熒光標記的特異性抗體(ti) （抗原）直接加在抗原（抗體(ti) ）上，經一定的溫度和時間染色，水洗—幹燥—封片—鏡檢

優(you) 點：操作簡便、特異性高、非特異性染色少

缺點：敏感性低

方法二：間接法

步驟：先用已知未標記的特異性抗體(ti) （一抗）與(yu) 抗原反應，再用標記的抗體(ti) （二抗）與(yu) 其反應，形成抗原—抗體(ti) —抗體(ti) 複合物，水洗—幹燥—封片—鏡檢

優(you) 點：敏感性強，目前多采用間接法

缺點：操作複雜

實驗過程中常見的問題：

1，整個(ge) 細胞片都出現熒光高點

原因有二：一是二抗濃度過高，適當降低二抗濃度即可。二是二抗發生沉澱，可以使用過濾或者離心熒光標記二抗

2，信號弱或無信號，染色細胞過少

目標蛋白在細胞中沒有表達，需要製備細胞裂解液，用Western   Blotting驗證目標蛋白在細胞中是否表達。

表達目標蛋白的細胞過少，標本中使用更多的細胞，試用其他瞬時轉染方法，或者使用穩定轉染細胞係。

細胞通透性差，需要增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透劑

染色前的固定步驟破壞了抗原表位，改用其他固定方法。

通透使抗原丟(diu) 失，可以減少通透劑作用的時間或強度。

抗體(ti) 不識別，需要換用其他抗體(ti)

一抗稀釋度過大，使用同一樣品按*的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定*的一抗稀釋比例。

二抗選擇錯誤，要使用正確的二抗

3，鏡下觀察隻有DAPI的藍光，目的熒光幾乎沒有或者很弱

出現這種現象很有可能是抗體(ti) 比例太低，需提高抗體(ti) 濃度，可配合提高二抗濃度；共聚焦的激發熒光強度不夠大；二抗孵育時是否是對應的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結果加為(wei) 山羊抗兔。

4，細胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點

這種情況一般是支原體(ti) 汙染所致，建議用殺支原體(ti) 藥2周後再檢測，或者通過提高共聚焦機器背景值來覆蓋支原體(ti) 熒光

5，如何共定位的視野

共定位時，首先判斷哪些細胞是轉染成功的，比如我過表達了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位關(guan) 係，則在視野中尋找已成功轉染蛋白A的細胞，一般熒光強度會(hui) 顯著高於(yu) 周邊其他細胞，再在這個(ge) 細胞上觀察蛋白B的表達。

6，視野中細胞與(yu) 細胞之間存在散在的發光點

有兩(liang) 種情況可造成：1，拍照時PBS量過少引起的非特異性；2，PBS未過濾，未溶解的殘渣黏附而導致

三、除此之外，這些注意事項也要牢記

1、合適的抗體(ti) 稀釋比例

通過優(you) 化抗體(ti) 稀釋比例來優(you) 化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體(ti) 或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是*次使用該抗體(ti) 或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。

2、抗體(ti) 特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體(ti) ，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體(ti) 的效果很好，但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用隻有二抗染色的片子

3、細胞固定和通透

為(wei) 達到*的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關(guan) 鍵，細胞和抗原需要保證*的結構，並利於(yu) 抗體(ti) 與(yu) 抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之後用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對於(yu) 核內(nei) 抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時，要注意它會(hui) 引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個(ge) 抗體(ti) 孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

4、封閉條件的優(you) 化選擇

為(wei) 了防止內(nei) 源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價(jia) 格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說是的封閉血清。另外封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉後不用洗滌，直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的選擇

封閉過後需要一抗孵育，可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h，以筆者的經驗是一抗孵育4度過夜比較好，抗原抗體(ti) 結合會(hui) 比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體(ti) 說明書(shu) 來，再根據自己具體(ti) 的實驗要求進行優(you) 化。如果抗體(ti) 濃度過低，會(hui) 造成信號太弱，如果抗體(ti) 濃度過高可能會(hui) 造成背景染色太強。熒光二抗個(ge) 人感覺Alex flour熒光基團信號強於(yu) Dylight強於(yu) FITC。如果做免疫雙標，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。